酶动力学：酪氨酸酶-酪氨酸

学习目标

完成本节课程并完成个人报告后，你应该能够：

• 解释 酶动力学 的基础知识。
• 配制已知浓度的商业酶溶液。
• 优化双光束紫外-可见温控光谱仪的采集参数以获取动力学信息。
• 解释酶作用的 Michaelis-Menten机理（米氏机理）。
• 解释 Michaelis-Menten常数（米氏常数）的含义。

理论背景

催化剂虽然参与反应，但在其催化的反应中既不被消耗也不产生。事实上，催化剂在反应结束后会再生。通常，如果改变反应的能量图景使反应在能量上更有利，则实现了催化。这是通过改变反应物在通往产物途中所经历的中间体来实现的，从而降低了总的 活化能。也就是说，会形成相同的产物，但是通过不同的路径。据推测，当活化能垒降低时，反应进行得更快。此外，催化可以细分为两种类型：多相催化和均相催化。多相催化是指催化剂和反应物处于不同的物理状态（相）。同样地，均相催化是指反应物和产物都处于相同的物理状态（相）。

大多数生物化学反应是由酶催化的，酶是一类蛋白质。由氨基酸的多样性提供的复杂性意味着高水平的结构多样性，从而带来化学多样性。因此，酶提供了生物体化学过程所需的高水平的选择性和周转率。

在本实验中，我们将研究 酪氨酸酶 对 L-酪氨酸 的作用。酪氨酸酶是一种 多酚氧化酶，是一种含铜酶，它通过一系列中间体将酪氨酸 氧化 为深色的多酚化合物：黑色素 ${ }^{1}$。在下面的反应方案中，第一步是整个过程的 决速步（或限速步）。这意味着 酪氨酸酶 将 L-多巴（L-DOPA）转化为 L-多巴醌（L-dopaquinone）的效率高于将 L-酪氨酸 转化为 L-多巴 的效率。

在实验上，我们将监测恒温下由于 L-多巴 的形成导致的 285 nm 处的 吸光度 变化，L-多巴色素（L-dopachrome）在 310 nm 处的变化，以及 黑色素 在 485 nm 处形成的变化。

酶动力学 可以通过一系列假设来建模：反应物（或 底物）（S）接近酶（E）并吸附到酶的 活性位点，形成 活化络合物（ES），通常称为 酶-底物络合物。这一步是 扩散受限 的，因此相对较慢。此时，反应迅速发生并且 产物（P）解离。结果是，虽然反应在实际中可能是 可逆 的，但在很好的近似下可以将其视为 不可逆反应。如果释放的 自由能 很大，并且 底物浓度 远大于 产物浓度（从而根据 勒夏特列原理 不利于逆向进行），这是一个很好的近似。还假设任何时候的 游离酶浓度 为 $[E]=[E]_{0}-[E S]$，即初始酶浓度与 酶-底物络合物 之间的差值。这一组关于酶的假设构成了 Michaelis-Menten动力学（米氏动力学） ${ }^{2}$。在化学上，该过程通常表示如下：

速率常数 $k_{1}$ 描述 ES 的形成，而 $k_{2}$ 描述该过程的逆过程。最后，$k_{3}$ 描述 产物（P）从 ES 络合物 中的释放和酶（E）的再生。基于上述描述性假设，我们将 稳态假设 应用于 ES。

$$\begin{equation*} \text { Rate }=V=-\frac{d[S]}{d t}=k_{1}[E][S]-k_{2}[E S] \tag{1} \end{equation*}$$

$$\begin{equation*} \text { Rate }=V=\frac{d[P]}{d t}=k_{3}[E S] \tag{2} \end{equation*}$$

稳态假设：ES 生成的速率与它被消耗的速率相同

$$\mathrm{E}+\mathrm{S} \underset{\mathrm{k}_{2}}{\stackrel{\mathrm{k}_{1}}{\rightleftarrows}} \mathrm{ES} \xrightarrow{\mathrm{k}_{3}} \mathrm{P}+\mathrm{E}$$

这意味着：

$$\begin{align*} & \frac{d[E S]}{d t}=k_{1}[E][S]-\left(k_{2}+k_{3}\right)[E S]=0 \tag{3}\\ & {[E S]=\frac{k_{1}}{k_{2}+k_{3}}[E][S], \text { but }[E]=[E]_{0}-[E S] \Rightarrow[E S]=\frac{k_{1}}{k_{2}+k_{3}}[S]\left([E]_{0}-[E S]\right)} \tag{4}\\ & \frac{[E]_{0}-[E S]}{[E S]}=\frac{[E]_{0}}{[E S]}-1=\frac{k_{2}+k_{3}}{k_{1}} \frac{1}{[S]} \Longrightarrow[E S]=\frac{k_{1}[S][E]_{0}}{\left(k_{2}+k_{3}\right)+k_{1}[S]} \tag{5} \end{align*}$$

除以 $k_{1}$ ：

$$[E S]=\frac{[S][E]_{0}}{\frac{\left(k_{2}+k_{3}\right)}{k_{1}}+[S]}$$

由方程(2) 并命名 $k_{m}=\frac{\left(k_{2}+k_{3}\right)}{k_{1}}$，即 Michaelis-Menten常数（米氏常数） ⟹

$$\begin{equation*} \text { Rate }=V=\frac{k_{3}[S][E]_{0}}{k_{m}+[S]} \tag{6} \end{equation*}$$

当 底物 的 浓度 高到整个酶都结合在 酶-底物络合物 中或 $[E]_{0}= [E S]$ 时，达到最大 速率 $V_{\text {max }}$，在这种情况下方程 (3) 变为：

$$\begin{equation*} V_{\max }=k_{3}[\mathrm{E}]_{0} \tag{7} \end{equation*}$$

因此方程 (6) 可以用方程 (7) 重写为：

$$\begin{equation*} \text { Rate }=V=\frac{V_{\max }[S]}{k_{m}+[S]} \tag{8} \end{equation*}$$

当针对上述酶模型绘制速度与 底物浓度 的关系图时， 大致开始存在三个区域。 在这个图中，Michaelis-Menten常数（米氏常数） $k_{m}$ 或酶的 结合亲和力 等于反应达到最大速度 $V_{\text {max }}$ 一半时的 底物浓度 $[\mathrm{S}]$。取方程 (8) 的倒数，

$$\begin{equation*} \frac{1}{V}=\frac{K_{m}}{V_{\max }} \frac{1}{[S]}+\frac{1}{V_{\max }} \tag{9} \end{equation*}$$

因此，通过绘制 $1 / V$ 对 $1 /[\mathrm{S}]$ 的图，得到线性关系，即 Lineweaver-Burk图（林-伯氏图） ${ }^{\text {3 }}$

如果在 等温 条件下通过改变 底物浓度 并保持酶 浓度 不变来研究酶促反应，可以从图中获得 Michaelis-Menten常数（米氏常数） $k_{m}$，以及 酶-底物络合物 的 分解速率 $k_{3}$。然而，该图不能给出构成 Michaelis-Menten常数（米氏常数）的单独常数 $k_{1}$ 和 $k_{2}$。

$$k_{m}=\frac{k_{2}+k_{3}}{k_{1}}$$

在本实验中，Lineweaver-Burk图 用于证明特定的 酶-底物络合物 遵循 Michaelis-Menten机理。

1.1 实验部分

1. 打开用于样品和 储备液 的 $25^{\circ} \mathrm{C}$ 温控 浴。
2. 打开 Cary WinUV 软件并选择 Kinetics（动力学）应用程序。等待仪器初始化。
3. 点击 SETUP（设置）
4. 点击 Cary 选项卡并选择

• Wavelength (nm)（波长）：285; 310; 485
• SBW (nm) [光谱带宽，从 单色器 出射的半峰高处的宽]：1.000 nm
• Ave Time (s)（平均时间）：0.1 这是光谱仪将对 吸光度 信号进行平均的斩波器周期数。一个斩波器周期为：0.333 s，因此 0.1 秒将导致 动力学 数据点为三个光谱仪读数的平均值。
• Y Mode（Y轴模式）：Abs（吸光度）
• Y Min（Y轴最小值）：0.000 Y Max（Y轴最大值）：2.000
• Simple Collect（简单采集）：勾选复选框。这将允许在整个 动力学 运行中采集一个采集 速率。
• 点击 Reports（报告）选项卡并选择：Graph（图表）；Include x-y pairs（包含x-y对），Autoconvert（自动转换）：Select ASCII (csv)（选择 ASCII csv格式）

5. 将 70 mg 酪氨酸 溶解在 500 mL 容量瓶中（ $7.73 \times 10^{-1} \mathrm{mM}$ ）。确保在定容至刻度线之前完全溶解。
6. 将整瓶 酪氨酸酶 溶解在 2 L 容量瓶中。确保在定容至刻度线之前完全溶解。这是酶 储备液。
7. 配制包含 8 mL 酶 储备液、6 mL 去离子水（DW）的溶液，充分混合。将溶液装入 比色皿 中并将其放置在 参比 架（位置 7）中。这将作为所有四次运行的空白对照。
8. 对于每次运行，按照下表所示在广口试管中混合 酪氨酸 储备液 与酶 储备液 和水来制备样品。

Run (运行)	Enzyme stock<br> (mL) (酶储备液)	Tyrosine stock<br> (mL) (酪氨酸储备液)	DW (mL) (去离子水)
1	6	8	0
2	6	6	2
3	6	4	4
4	6	2	6

9. 将装有样品的试管浸入 恒温槽 中以便发生 氧化。
10. 三分钟过去后，转移一份样品的 等分试样 到 比色皿 中，并将其放置在样品架（位置 1）中。
11. 开始数据采集（Stage 1（阶段1）；Cycle (min)（周期）：5.00 ；Stop (min)（停止）：60.00）。
12. 对于每次运行，光谱仪将针对每一个波长绘制 A（吸光度）对 time（时间）的图。

1.2 数据处理

1. 你已经绘制了 吸光度 变化随时间变化的图。利用 吸光度 变化对时间的曲线的初始 斜率，获得 反应速率。确保拟合尽可能多的点，只要趋势保持线性。单位将是 吸光度 单位/s。从 A 对 t 曲线的初始 斜率 获得在 $285 \mathrm{~nm}, 310 \mathrm{~nm}$ 和 485 nm 处的 反应速率。
2. 为每个波长绘制 Lineweaver-Burk图。获得每个波长下的 $\mathrm{K}_{3}$ 和 $\mathrm{K}_{\mathrm{m}}$ 值。
3. 在假设 $\mathrm{K}_{\mathrm{m}}$ 是一个 解离常数 的前提下解释两个波长处的数据，并评论这个假设是否合理。

1.3 讨论

1. Velocity（速度）指的是什么？为什么它被称为速度？
2. 如何解释 $K m$ ？解释各种条件及其对你解释 $K m$ 的影响。$K m$ 的这些解释中是否有适用的？
3. 如果我们要使用 底物 的 D-异构体 代替，动力学 会呈现怎样的表现？
4. 记得从 Arrhenius方程（阿伦尼乌斯方程）中可知，在不同温度下进行多次运行可以揭示关于反应 活化能 的信息。在我们的案例中求解 活化能 是否可行？为什么可行或不可行？
5. 找到一个提出的 机理（通常是有争议的），提出另一种可以测量该过程 动力学 的方法。

1.4 参考文献

1. C. R. Dawson and W. B. Tarpley. In Summer, J. B., and Myrback, K. (eds). The Enzymes. Volll, Part 1, Chapter 57, Academic Press, New York, 1951.
2. L. Michaelis and M. L. Menten, Biochem. Zschr., 49, 333 1913, 333.
3. H. Lineweaver and D. Burk, D. J. Am. Chem. Soc. 56, 658, 1934.